利用液氮罐進行畜牧業中牛的人工授精基本技術操作規程

        人工授精是用器械采取公畜的精液，再用器械把精液輸入到發情母畜生殖道內，以代替公母畜自然交配的一種配種方法。人工授精不僅有效地改變家畜的交配過程，更重要的是提高了公畜配種效能。人工授精只用于健康的公母畜，可防止各種疾病，已成為現代畜牧業的重要技術之一。
一、牛的發情鑒定
母牛的發情周期平均為21天，正常母牛發情周期的間隔時間變化很小，牛的發情期一般為1.5～3.5天。母牛發情時興奮不安，吼叫，爬跨其他母牛，外陰部光滑腫脹、發紅，陰道粘膜濕潤，分泌出清亮的粘液，產奶量下降，食欲減退，嗅其它母牛尾根。母牛發情時其卵泡開始發育成熟最后排卵，是因為卵泡受到腦垂體前葉分泌的促卵泡激素和促黃體素的刺激而實現。一般根據牛的外部表現來判斷母牛的發情，但為了確定排卵的具體時間，則必須作直腸檢查，觸摸卵巢、卵泡的發育情況。
    二、最適輸精時間
輸精時間一般因母牛的年齡、品種、胎次、營養水平的不同而有所差異，一般母牛發情期中輸精**時間是發情開始后12小時到發情終止或排卵前的12小時內。

三、器械和藥物準備：
1、藥業的配制75%酒精及75酒精棉球；1/3000新潔爾滅溶液；生理鹽水棉球。
2、器械30L液氮貯存罐；牛用輸精器；高壓滅菌器。
3、器械的洗滌人工受精用的器械在每次使用以后，用洗滌劑洗刷干凈，并需保持清潔、干凈。
四、冷凍精液貯存
1、在液氮貯存館內貯存的冷凍精液，必須切實地浸沒于液氮中。
2、取放貯存冷凍精液的提筒只允許上提到液氮的管頸段之下，嚴禁提出罐外，在罐內脫離液氮的時間不得超過10s。
3、在向另一
液氮罐

內轉移凍精液時，精液提筒不得脫離液氮5s。
4、取放冷凍精液之后，應及時蓋上罐塞，以減少液氮消耗及防止異物落入罐內。
5、嚴防不同品種、個體公畜的冷凍精液混雜，難以辨識。
6、對長期用作貯存冷凍精液的液氮罐應定期清理和洗刷。
五、解凍
解凍時把細管精液從液氮中取出，操作時間越短越好，時間過長，可影響其他未解凍精液的品質。解凍時把細管浸入40℃左右的溫水中15秒左右，待管內精液的顏色發生變化后即可取出，在解凍時不要讓精液升溫過高。細管精液取出后，先用紗布擦凈細管表面的水，握住手掌稍微揉一揉，最后將細管的封閉端剪掉，推進輸精器里面，準備輸精。
六、輸精時間
選擇最適宜的時間輸精，才能保證生活力強的精子和卵子在受精部位相遇，提高受胎率。輸精時間太早，精子喪失受精能力或死亡，不能使卵子受精;輸精時間太遲，即使精子受精能力強，卵子排出時間太久，卵子衰老了也不能受精。母牛排卵后的受精能力為20～24小時，精子在母牛生殖道中受精能力為28～50小時，一般母牛發情初期輸精受胎率低，發情后12小時或排卵前8小時輸精最為合適。
輸精方法
母牛需經發情鑒定及健康檢查后才能給予輸精。接受輸精的母牛先要保定，牛一般站在輸精架內輸精，沖洗牛的外陰部并消毒，輸精員的指甲要剪短磨光，洗滌擦干，并用75%酒精消毒。戴長臂手套采取直腸把握法輸精時，先由左手掏出糞便，再伸入直腸，尋找并握住子宮頸，用胳膊壓開陰門，右手持輸精導管插入陰門，先向上傾斜避開尿道口，再轉入水平直向子宮頸口，借助進入直腸內的一只手固定和協同動作，將精液輸入子宮內或子宮頸5～6厘米處，最后輕輕地拉出輸精器。輸精母牛須做好記錄，各項記錄必須按時，準確，并定期進行統計分析

七、討論和小結
為了提高受胎率，必須掌握影響受胎率的因素。決定受胎率的主要因素有：種公牛精液品質，母牛發情排卵機能，人工授精技術操作質量，輸精時間等。

牛冷凍精液人工授精技術操作規程
1　范圍
    本標準規定了人工授精站具備的條件、輸精器械的清洗消毒、凍精的運輸保存、母牛的發情鑒定、母牛的輸精操作、母牛的妊娠檢查。
    本標準適用于全省各養牛場、戶母牛的冷凍精液人工授精技術操作。
    2　人工授精站具備的條件
    2.1 人工授精站應建在交通方便、能繁母牛相對集中的地方。人工授精站的建立應符合當地良種牛推廣和改良規劃。
    2.2從事牛冷凍精液人工授精操作的人員須取得縣級畜牧行政主管部門頒發的上崗證。
    2.3人工授精站設置凍精貯存室和輸精操作室。
    2.3.1凍精貯存室安裝空氣消毒設備，室內保持清潔干燥，窗明臺凈。
    2.3.2輸精操作室設在向陽、干燥的地方，室內安裝母牛保定架。
    2.4 人工授精站應配備液氮生物容器、顯微鏡、卡蘇槍、鑷子、細管剪、溫度計等器械。
    3　輸精器械的清洗消毒
    3.1 各種器械用后先用肥皂水或2％的小蘇打水洗刷除污， 再用溫開水沖洗干凈。
    3.2 玻璃、金屬器械、膠球(用紗布包好)和布類用蒸汽滅菌三十分鐘或干熱滅菌。金屬和玻璃器械也可用75％的酒精擦拭和吸注消毒，并在酒精火焰上烘干。
    3.3輸精器用后及時清洗、消毒。每配種一頭母牛，須使用一支消毒過的卡蘇槍。塑料外套管只能使用一次。
    4　凍精的運輸保存
    4.1凍精要貯存在裝有足夠液氮的生物貯存容器中，定期添加液氮。容器內的凍精不得暴露在液氮面外。
    4.2在運輸液氮、凍精時，應使用生物運輸容器。用車輛運輸時，除利用原保護套外，應另加木箱或其它保護裝置加以固定。
    4.3從容器內取凍精時，只能將提筒置于容器頸下部，用長柄鑷夾取凍精。如10秒鐘內尚未取放完畢，應將提筒放回液氮中浸泡一下再繼續提取。  
    4.4、貯存的凍精需向另一容器轉移時，凍精**浸泡在液氮中進行。凍精在空氣中暴露的時間不得超過5秒。
    5　母牛的發情鑒定
    5.1外部觀察法：母牛表現出興奮、站立不安、哞叫、食欲減退、頻尿、外陰部濕潤、腫脹、流透明粘液等征狀，可判斷為發情。
    5.1.1 發情初期：母牛興奮不安，追爬其他母牛，但拒絕爬跨；****腫脹，粘液透明，不呈牽絲狀，粘性強。
    5.1.2 發情盛情：母牛溫順，接受爬跨，****腫脹。粘液透明，量多，呈牽絲狀，粘性強。
    5.1.3發情末期：母牛拒絕爬跨，****腫脹消退，粘液半透明、粘稠，粘性差，牽絲較短。
    5.2直腸檢查法：發情母牛子宮頸稍大、較軟，子宮角體積增大，子宮收縮反應明顯。
    5.2.1發情初期：卵泡直徑0.5厘米左右，觸診時為一軟化點。5.2.2發情盛期：卵泡增大到1～1.5厘米，呈圓形，明顯突出于卵巢表面，波動明顯。
    5.2.3發情末期：卵泡不再增大，泡壁變薄，緊張度增加，有一觸即破之感。
    6　母牛的輸精操作
    6.1凍精的準備
    6.1.1凍精應來自于取得農業部頒發的《種畜禽生產經營許可證》的凍精生產站。
    6.1.2發情母牛的每次輸精量為細管凍精一支，凍精解凍后的精子活力不低于0.3。
    6.1.3用38土2℃溫水直接浸泡30秒鐘解凍細管凍精。將解凍的細管剪去頂部封口后插入卡輸槍，套上塑料外套管備用。
    6.2母牛的輸精時間
    6.2.1母牛的適宜輸精時間在發情末期。
    6.2.2發情母牛一個情期輸精兩次的，其間隔時間為8～12小時。
    6.3輸精母牛的準備
    6.3.1將輸精母牛固定在保定架內，用細繩拴好尾巴拉向一側固定。
輸精人員將手指甲剪短、磨光，戴上長臂手套。對輸精母牛肛門及外陰進行消毒后擦干。     6.3.2
6.4輸精方法：輸精人員將一只手伸入母牛直腸內，尋找并握住子宮頸的外口端，手臂往下按壓使陰門裂開，另一只手把準備好的卡輸槍自陰門向斜上方插入5～10厘米(避開尿道口)，再改為平插，把卡輸槍送到子宮頸外口，然后兩手互相配合，使卡輸槍緩緩越過子宮頸管中的皺壁輪，將精液注入子宮頸內。
 7　母牛的妊娠檢查
     7.1外部觀察法
     7.1.1母牛配種后二、三個情期仍未出現發情者，可初步認為妊娠。
    7.1.2母牛妊娠三個月后，性情變得溫順，食欲增加，被毛出現光澤。妊娠五、六個月后，腹圍增大，右側腹壁突出，可在腹壁觸到或看到胎動。
7.2直腸檢查法
7.2.1母牛妊娠一個月，兩側子宮角不對稱，角間溝清楚。孕角較空角稍大變粗、柔軟，有液體波動感，彎曲度變小。孕側卵巢較大，有黃體突出于表面。子宮中動脈如麥稈粗。
    7.2.2母牛妊娠二個月，孕角比空角粗約兩倍。角間溝平坦。孕角薄軟，波動明顯。孕側卵巢較大，有黃體。孕側子宮中動脈增粗一倍。
    7.2.3母牛妊娠三個月，孕角大如耍兒頭，波動感明顯，空角比平時增粗一倍，子宮開始沉入腹腔，角間溝已摸不清楚。孕側子宮中動脈增粗2至3倍，有時可摸到特異博動
  。

牛塑料細管冷凍精液
人工授精技術操作規程
   家畜冷凍精液人工授精是近代畜牧科學的一項新技術，新疆維吾爾自治區近幾年的黃牛改良工作實踐證明它可以不受時間、地點的限制，可擴大最優秀種公牛的配種利用效率，有力地加快家畜配種改良的進程，它比常規人工授精具有更高的操作要求和科學性，為加強廣大基層操作人員的責任心，進一步提高細管凍精配種的技術水平，使細管凍精人工授精技術操作規范化，保證冷凍精液授精的受胎效果，特制定本操作規程。
    1、 液氮罐人工授精人員
   （1）人工授精人員必須具有家畜繁殖基礎理論知識，熟練掌握細管凍精人工授精的各個主要技術環節。例如：細管冷凍精液的保存、運輸、解凍，精液品質鑒定、貯氮、貯精容器的使用，母畜生殖器管的解剖生理，發情鑒定、直腸把握子宮頸輸精及妊娠診斷等技術，必須了解、掌握，并熟練應用于實際中，掌握基本的消毒滅菌的方法，控制預防和治療母畜生殖器官傳染病及母畜產科疾病的知識。
   （2）人工授精人員要刻苦鉆研業務技術，經縣以上主管部門考核合格，發給合格證書方能從事細管凍精人工授精業務，主管部門應按其技術高低分別授予不同的技術職稱，對工作成績低劣，責任心不強，長期不能完成冷配受胎任務者，應停止輸精業務，進一步進行技術培訓。人工授精員要相對穩定于一定區域或崗位，以利熟悉情況和鞏固結果。
   （3）人工授精站點及人工授精員設置應有規劃，各地州縣可根據自己的具體情況安排實施，原則上單罐年配種量應達250頭以上，單罐輸精配種頭數愈多，愈有利于降低配種成本。
    2、細管冷凍精液的劑型及質量標準
目前，新疆維吾爾自治區可供采用的牛凍精劑型主要由兩種：即顆粒凍精、細管凍精，目前主要以細管凍精為主。
   （1）顆粒凍精必須達到下列標準：劑量每顆粒0.1亳升±0.01；解凍活力不低于0.35（即35%前進運動精子）；解凍后精子畸形率20%，頂體完整率40%以上；衛生指標：無國標GB4143-84規定的各種傳染性疫病；每毫升細菌菌落數不得高于1000個，解凍后的精液中無病源性微生物。
   （2）塑料細管凍精：劑量主要以0.25ML為主，每劑有效精子數不低于1000萬個，其它與顆粒凍精相同。
細管精液每個劑量上的標準應清晰，包裝完整、準確、細管封口嚴密、無裂痕。
    3、運輸
   （1）購買凍精運輸人員一定要了解凍精的基本原理，挑選責任心強，工作細致，具有凍精檢查能力者承擔，運輸前要檢查容器的質量，看是否安全適用，并定時檢查液氮的消耗情況，及時添加液氮，運輸前后一定要保證細管凍精完全浸泡在液氮中，如發現液氮消耗過多或罐的外殼有水珠或掛霜，說明罐的保冷性能有問題，應及時更換。
   （2）對液氮罐要細心愛護，搬運時要握住手柄，抬起罐體不得拖行、躺放、倒置、疊放，裝好液氮的罐子，要及時罩上皮套、棉套或裝入紙盒或木箱，嚴防撞擊或翻倒。盛有精液的液氮罐嚴禁在陽光下直曬。
   （3）凍精運輸前后應辦好交接手續，填寫卡片、簽名、精液要抽樣檢查，達不到質量標準應拒絕接受（簽名），亦不得發放用于輸精。
    4、保存
   （1）液氮罐要專人負責保存，使用和保養，放置在室內干燥、通風和安全處，罐下應墊以木板，離地面二十至三十厘米高，室內不準吸煙，不住人。
   （2）為便于分發和使用凍精，罐口外面必須拴系有標簽，標記品種名稱、種公牛號，罐內凍精標記有凍精制作時間，解凍活力制作單位，細管（或顆粒）數量，品種代碼及種公牛號等，新疆維吾爾自治區畜禽繁育改良總站生產的細管凍精印字標記，順序為日、月、年—站名—品種代碼—牛號，例如[05、11、2000、自治區改良站、XM、2415]或年、月、日—站名—品種代碼—牛號。
   （3） 取放細管凍精時，一定做到動作穩、準、快，在室溫下，凍精由一個液氮容器轉移到另一個液氮容器時，操作時間不得超過5秒鐘。單個取用時不宜將整個精液袋提至液氮頸口上，暴露在空氣中，精液取用或轉移完畢后，立即加上蓋塞。如果分取的精液數量較多，必須準備另一個盛有液氮的廣口容器，在盛有液氮的容器中進行分裝或計數。
   （4）貯精罐要每隔5—7天檢查稱重一次，保管精液的人員要了解每個罐液氮消耗情況。一般我們要了解液氮罐的消耗情況可依據公式得出結果：總重量減去液氮罐重即得液氮重（公斤數），除以系數0.808即可得知罐內液氮公升數。當罐內液氮容量低于全容量的三分之一時，需及時補充添加液氮以防精液報廢。
   （5）凍精貯存器至少每年或每個配種期結束時要徹底清洗一次。清洗時將罐內存留的液氮全部倒凈，取出殘留在罐底的細管凍精（顆粒凍精棄之），經過兩天左右待容器內的溫度上升至室溫，以40℃—50℃的溫水或中性洗滌劑，用細軟的紗布擦洗干凈，并敞口涼干內部。有條件的地方可用40℃—50℃熱空氣吹干封閉，保存備用。
   5、藥械準備
  （1）各改良點或人工授精配種網點，要備齊各種人工授精必用的器械和藥品，細管凍精不需要解凍液，但需準備有檢查活力的蓋玻片與載片、保溫箱、卡蘇輸精器、細管剪刀等常用設施。
   （2）器械消毒準備，器械在使用前必須檢查有無破損或失靈，輸精器及配種所需的外套、細管剪刀等無菌保存所用的毛巾等用洗衣粉溫水洗凈，然后用清水洗干凈，再用蒸溜水沖洗兩遍，瀝干水分。
   （3）藥液配制，配制各種藥液和解凍液前，應先調整好天平，使藥品稱量準確，溶液中所用的蒸餾水體積要量度準確，顆粒凍精解凍常用的2.9%檸檬酸鈉液一般現用現配，亦可制成安瓿，保存在0℃—5℃的冰箱中，隨時取用。
    6、細管凍精解凍
   （1）首先將38℃—40℃的溫水倒入敞口鋁式飯盒中，調試好溫度，并從液氮中迅速取出細管凍精投入水中快速擺動10—15秒鐘，取出后用干凈紗布擦去水珠，并放入手掌中快速搓動數下使細管中的精液混勻，為使精液在解凍后可以保存較長時間，以及為了防止輸精時室溫過低對已經升溫的精液產生不良影響，在解凍時不要讓精液升溫過高。冷凍精液一般要求輸精前幾分鐘，最多不超過15分鐘前解凍，并立即使用。必要時也可體溫化解，也可35℃水浴30秒解凍，裝槍前必須借助手溫快速搓動，使溫度回升精液復蘇再輸精，此解凍方法配種技術熟練的人員可嘗試，目前不積極提倡。
   （2）解凍后的細管凍精用凈衛生紙或消毒棉紗擦干，用細管專用剪刀平直橫剪封口前端1.2—1.5CM后棉塞端裝入輸精槍準備輸精。
   （3）細管凍精也可采用35℃水溫30秒鐘解凍，此方法可延長精子存活時間，冷配技術熟練人員可嘗試。
   （4）細管凍精在解凍后應檢查精子活力，標準鏡檢溫度37℃—38℃，活力檢查需在解凍后3—5分鐘精子完全復蘇時進行，解凍活力不足0.35不得用以輸精，活力評定應取多視野，多液層平均值，解凍精液宜在解凍后立即使用，最多不超過15分鐘。
   （5）基層各配種站點一定要規范試驗室操作方法，配齊簡易檢測設備，如：保溫箱、載片、蓋片、細管剪刀等，而且一定要強調檢查活力的試驗室室溫不能低于15℃，保溫箱溫度不能低于37℃，從而抑制精子活力的復蘇。同時，所有檢查精子活力的器械設備一定要保持清潔干凈，避免人為的因素造成檢查精子活力偏低的種種問題出現。
    7、輸精
   （1）母牛發情鑒定：“以直腸檢查為主，結合觀察詢問、檢查紀錄等綜合判斷”為準繩的原則進行人工授精。輸精適宜時間應在發情末期，即排卵前0—12小時，**在排卵前6小時，排卵后立即追配一般效果稍差。
   （2）輸精方法應采用直腸把握子宮頸深部輸精法。輸精動作要柔和、快捷，做到“輕插、適深、緩注、慢出”。輸精劑量必須準確，防止夾吸母牛努責（努責時可將母牛稽甲部捏抓幾下）殘留精液過多或嚴重努責時應補輸一劑。冬季氣溫低寒時應防止精液受冷打擊，輸精槍應用消毒毛巾包裹為佳。
   （3）輸精人員必須有嚴格無菌操作觀念，輸精前結合直檢卵泡發育，掏盡糞便。輸精前應用千分之一的高錳酸鉀水清洗母牛后軀，重點為肛門、會陰、尾根，擦干后用消毒生理鹽水棉球擦凈外陰部及陰門裂內部，不得有糞便污染。輸精器必須在無污染的情況下直接插入陰道，隨后再用另一只手插入直腸，把握子宮頸，每輸精一次必須更換一支輸精器外套。（嚴格講外套只需使用一次，但根據我區實際，輸精器外套可重復使用數次，但應嚴格消毒）
    （4）輸精后，應檢查殘留量及未滴的精子活力，如劑量不足，活力明顯下降，應檢查原因，并作補輸。
     8、記錄統計及報表
     （1）母牛繁殖記錄表，每頭母牛登記一張，配種時認真逐項填寫，并長期保存，并將冷配產犢公、母性別登記準確，按時統計上報。
     （2）評定細管凍精配種效果，主要以**情期受胎率的高低為標準，一般我們也以平均情期受胎率為標準。